隨著生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)基因的功能研究更加透徹，為了進(jìn)一步研究和改造基因的目的需要詳細(xì)了解生物的基因組全序列，因?yàn)镈NA序列是改造基因的基礎(chǔ)，這就要求具有高效的dna測(cè)序技術(shù)。DNA測(cè)序技術(shù)到目前為止已經(jīng)發(fā)展到了第三代測(cè)序技術(shù)。
早的Sanger測(cè)序在人類(lèi)基因組計(jì)劃中立下赫赫戰(zhàn)功，但也給基因組測(cè)序貼上了數(shù)億美元的價(jià)格標(biāo)簽，讓人生畏。這兩年發(fā)展迅猛的**代測(cè)序儀——Illumina的Genome Analyzer、Roche 454的GS系列以及ABI的SOLiD系統(tǒng)——讓人類(lèi)基因組重測(cè)序的費(fèi)用蹭地降低到10萬(wàn)美元以下。現(xiàn)在，能對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序的第三代測(cè)序儀也加入到這場(chǎng)比賽中，讓競(jìng)爭(zhēng)更加激烈。
目前，第三代測(cè)序主要有三種技術(shù)平臺(tái)。兩種通過(guò)摻入并檢測(cè)熒光標(biāo)記的核苷酸，來(lái)實(shí)現(xiàn)單分子測(cè)序。Helicos的遺傳分析系統(tǒng)已上市，而Pacific Biosciences準(zhǔn)備在明年推出單分子實(shí)時(shí)(SMRT)技術(shù)。第三種Oxford Nanopore的納米孔(nanopore)測(cè)序還尚未有推出的時(shí)間表，但有可能是這三種當(dāng)中便宜的。納米孔測(cè)序的優(yōu)勢(shì)在于它不需要對(duì)DNA進(jìn)行標(biāo)記，也就省去了昂貴的熒光試劑和CCD照相機(jī)。
近，Oxford Nanopore Technologies的Hagan Bayley及他的研究小組正致力于改善納米孔。根據(jù)他們之前的工作，他們以a-溶血素來(lái)設(shè)計(jì)納米孔，并將環(huán)式糊精共價(jià)結(jié)合在孔的內(nèi)側(cè)(下圖)。當(dāng)核酸外切酶消化單鏈DNA后，單個(gè)堿基落入孔中，它們瞬間與環(huán)式糊精相互作用，并阻礙了穿過(guò)孔中的電流。每個(gè)堿基ATGC以及甲基胞嘧啶都有自己特有的電流振幅，因此很容易轉(zhuǎn)化成DNA序列。每個(gè)堿基也有特有的平均停留時(shí)間，它的解離速率常數(shù)是電壓依賴的，+180 mV的電位能確保堿基從孔的另一側(cè)離開(kāi)。
a-溶血素納米孔(剖面圖)以及共價(jià)結(jié)合的環(huán)式糊精(淺藍(lán)色)瞬間結(jié)合落入孔中的堿基(紅色)。
以往對(duì)甲基胞嘧啶進(jìn)行測(cè)序，都要先進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化，而納米孔技術(shù)能直接讀出這第五種堿基。這對(duì)表觀基因組測(cè)序的研究人員來(lái)說(shuō)可謂是個(gè)好消息。
納米孔測(cè)序預(yù)計(jì)能滿足大部分測(cè)序用戶的需求：99.8%的準(zhǔn)確性相當(dāng)高，且錯(cuò)誤很容易通過(guò)計(jì)算來(lái)糾正。均聚物延伸也沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)榧{米孔記錄每一個(gè)堿基，而不管其前后的堿基。讀長(zhǎng)也會(huì)很長(zhǎng)。Bayley認(rèn)為：“它有可能讀取數(shù)千個(gè)堿基，序列質(zhì)量也不會(huì)下降。即使中途有一些小差錯(cuò)，它也可以重新開(kāi)始。”
但是，Oxford Nanopore的測(cè)序儀仍面臨兩個(gè)重要的技術(shù)問(wèn)題。一是如何將核酸外切酶更好地附著在孔上，讓它每次只掉入一個(gè)堿基，這是一個(gè)大挑戰(zhàn)。另一個(gè)是并行化。這個(gè)問(wèn)題可能簡(jiǎn)單一些。他們可以開(kāi)發(fā)出一個(gè)芯片，上面有數(shù)萬(wàn)個(gè)孔，來(lái)確保整個(gè)測(cè)序過(guò)程更快速。
在納米孔測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，實(shí)現(xiàn)千元基因組的目標(biāo)指日可待了。
基因測(cè)序技術(shù)始于上個(gè)世界70年代，到目前為止已經(jīng)發(fā)展到了第三代測(cè)序技術(shù)。第三代納米孔測(cè)序技術(shù)因?yàn)槠洳辉傩枰獰晒鈽?biāo)記物使測(cè)序價(jià)格大大降低，這項(xiàng)技術(shù)預(yù)示著基因測(cè)序技術(shù)又登上了一個(gè)新的臺(tái)階。
