PCR Master Mix的成分及使用簡介

進行PCR試驗時，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各種pcr反應所需的試劑，而在加入這些試劑時如果操作不規范很容易造成污染，導致PCR結果不準確，因此，為了簡化反復添加各種試劑便將buffer、dNTP、DNA Polymerase等試劑先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即簡化了PCR操作步驟，也減少了污染的途經。

一、產品簡介：

2×PCR Master Mix中含有2×Taq DNA Polymerase，2×PCR Buffer，2×dNTP，只需加入適量引物、模板和水即可進行pcr擴增。大大簡化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導致的污染，使PCR的重復性更好。

利用2×PCR Master Mix可以進行各種常規的PCR擴增，特別適合用于定量和半定量的PCR擴增，以及2kb以下DNA片斷的t載體克隆。

2×PCR Master Mix可以擴增出長達8kb的片斷，但通常更適合用于擴增2kb以下的DNA片斷。

本試劑盒用于50微升的PCR反應體系，足夠用于160個反應，用于20微升的PCR反應體系，足夠用于400個反應。

包裝清單：

二、保存條件：

-20℃保存。

三、注意事項：

由于PCR反應非常靈敏可以擴增目的基因序列超過1000萬倍，在使用Taq酶時請注意避免微量待擴增DNA的污染，并盡量考慮設置不加模板的空白對照以確認是否有待擴增DNA的污染。

Taq DNA polymerase在PCR過程中每循環的出錯幾率約為2.2x10-5，對于大于1kb的DNA片斷的克隆推薦使用出錯幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對于普通的PCR或RT-PCR定性檢測或定量檢測，Taq DNA polymerase是佳選擇。

為了您的**和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

四、使用說明：

1. PCR反應體系的設置：

a. 溶解并混勻PCR反應所需的各種溶液。將2XPCR Master Mix置于冰浴上或冰盒內。

b. 參考下表在冰浴上設置PCR反應：

對于不同類型的模板在50μl反應體積中推薦用量如下：

哺乳動物基因組DNA：0.1-1μg;大腸桿菌基因組DNA：10-100ng;質粒DNA：0.1-10ng。

過多的模板DNA容易導致非特異性的PCR產物。

c. 用移液器輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數秒，使液體積聚于管底。

d. 如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油

(mineral oil，ST275)。

e. 各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。

2. PCR反應參數的設置可以參考如下示例：

STEP1(起始變性): 94℃ 3min

STEP2(變性): 94℃ 30sec

STEP3(退火): 55℃ 30sec

STEP4(延伸): 72℃ 1min

STEP5(循環): Go To STEP2 for 30 cycles

STEP6(終延伸): 72℃ 10min

STEP6(臨時保存): 4℃ forever

a. PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的PCR反應條件

包括溫度、時間和循環數等。

b. STEP4(延伸)的時間設置需根據PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為1分鐘。例如

PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置

為2分鐘，以此類推。

c. 對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環數設置為35。對于需進

行半定量或定量的PCR反應循環數一定要進行適當優化，使PCR反應沒有達到平臺期。

五、常見問題：

1. PCR產物非常少或沒有特異性條帶。

a. 引物設計不佳是PCR過程中常見的問題。請選擇適當的引物設計軟件進行引物設計，注意引物的

GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點等的引物

中，一定要注意加入酶切位點等后整條引物的GC含量、二級結構、二聚體、退火溫度、長度、特

異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對照引物可以正常工作的情況下，可以

考慮更換引物。

b. 待擴增片斷GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會變得相對比較困難，此時可以使用適合擴增高

GC含量DNA片斷的GC-rich buffer，并相應地根據GC-rich buffer的要求或說明調整PCR反應參數

的設置。

c. 長片斷擴增。盡管Taq DNA polymerase可以擴增長達8kb的DNA片斷，但大多數時候比較適合擴

增3kb以下的片斷，更長片斷的擴增推薦使用其它更適合長片斷擴增的DNA聚合酶。

d. PCR反應設置時在室溫進行容易導致非特異性條件。推薦在冰浴上設置PCR反應。

e. 由于引物存在一定的二級結構或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導致退火效果不佳。此時

可以采用Touch down等方法進行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55或50℃的方法，使退火

更加充分。

f. 退火溫度不佳，需要優化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設置退火的溫度梯度，摸索退火的佳

溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應摸索佳的退火溫度。

g. 延伸時間不足。可按照每1kb片斷延伸1分鐘進行設置，對于較難擴增的片斷可以設置為每1kb片斷

延伸1.5-2分鐘。

h. 待擴增片斷GC含量較高或長度較長，變性不夠充分。可以調節起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃

2-4min。

i. 在不同PCR儀上進行PCR反應，避免有時PCR儀出現問題。

j. 循環數不足，適當延長PCR的循環數。通常循環數高不必超過40，常用的循環數范圍為25-35。

k. 模板含量太低，適當加大模板量，或采用巢式PCR(nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即為在原先設

計的PCR引物內側再設計一對PCR引物，然后對**次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，這

樣一方面可以起到擴增作用，同時也可以從**次PCR產物中擴增出特異性條帶。二次PCR則為比

較簡單地用原有引物對**次PCR產物進行稀釋后再進行一次PCR擴增，可以起到擴增作用，但不

能去除非特異性條帶。

l. 模板中含有抑制PCR反應的物質，可以用適當的DNA純化方法例如柱純化等純化模板DNA。

m. 當產生較多非特異性條帶時，可以適當提高退火溫度。

n. 注意設置適當的陽性對照和陰性對照通常會有很大幫助。

PCR Master Mix現今已經廣泛應用在各種PCR實驗中，如Real Time PCR、多重PCR、巢式PCR等。使用PCR Master Mix即可以簡化實驗操作，又可以避免因多次對PCR管進行操作所造成的污染問題。