鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白拓撲結(jié)構(gòu)新方法

4月18日，國際學(xué)術(shù)期刊《公共科學(xué)圖書館—綜合》(PLoS ONE)在線發(fā)表了中科院上海生命科學(xué)研究院生化與細胞所胡紅雨課題組的研究論文“A Redox-Sensitive Luciferase Assay for Determining the Localization and Topology of Endoplasmic Reticulum Proteins”。該論文應(yīng)用氧化還原敏感的Gaussia熒光素酶和綠色熒光蛋白GFP，報告融合蛋白所處的不同氧化還原環(huán)境，從而鑒定目標蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的亞定位及其拓撲結(jié)構(gòu)。

真核細胞中約有三分之一的蛋白質(zhì)進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進行折疊、修飾、膜整合、轉(zhuǎn)運和分泌，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)和跨膜蛋白在這些過程中發(fā)揮著重要的功能。但是，由于跨膜蛋白疏水區(qū)域與膜脂結(jié)合的復(fù)雜性，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的動態(tài)性，現(xiàn)有的鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和跨膜拓撲結(jié)構(gòu)的方法非常有限，且存在操作技術(shù)繁瑣等問題。

Gaussia熒光素酶(Gluc)是近年報道的分子量小、活性很高的熒光素酶，含有五對二硫鍵，需要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的氧化環(huán)境中才具有完全的發(fā)光活性。博士生李海音等利用Gluc的發(fā)光活性對氧化還原敏感的特性，將Gluc與GFP串聯(lián)表達作為新的報告基因，融合于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的不同位點，并在HEK 293T細胞中表達。他們以Gluc的發(fā)光活性檢測融合位點的氧化還原環(huán)境，而用GFP的熒光強度檢測融合蛋白的表達量，從而報告不同融合位點的相對氧化還原環(huán)境。

該方法可用于區(qū)分其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者細胞質(zhì)，以此鑒定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的定位和拓撲結(jié)構(gòu)，已成功應(yīng)用于單次跨膜蛋白(如calnexin、Sec61g 和CD3δ)和多次跨膜蛋白(如Herp和HRD1)的拓撲結(jié)構(gòu)。該方法靈敏度高、簡單快速，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白拓撲結(jié)構(gòu)的高通量鑒定成為可能。同時，也可進一步應(yīng)用于鑒定細胞膜蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)，以及檢測蛋白質(zhì)分泌途徑中的氧化還原環(huán)境變化，將為研究蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位、折疊、氧化還原和修飾，以及動態(tài)的膜整合、轉(zhuǎn)運和分泌提供更加適用、方便和高效的生化和細胞分析技術(shù)。